ทดสอบ Catalase: รากฐานเทคนิคและการใช้งาน
การ ทดสอบ catalase เป็นวิธีการที่ใช้ในห้องปฏิบัติการแบคทีเรียวิทยาเพื่อแสดงการมีเอนไซม์ catalase ในแบคทีเรียเหล่านั้นที่มีอยู่ พร้อมกับการย้อมสีกรัมเป็นการทดสอบหลักที่ควรดำเนินการกับจุลินทรีย์ที่แยกได้ใหม่ การทดสอบเหล่านี้เป็นแนวทางให้นักจุลชีววิทยาเกี่ยวกับขั้นตอนในการติดตามการระบุที่ชัดเจนของจุลินทรีย์ในคำถาม
โดยทั่วไปแล้วแบคทีเรียที่มีไซโตโครมนั้นมีเอนไซม์คาตาเลสซึ่งก็คือแบคทีเรียแอนแอโรบิคและแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตามมีข้อยกเว้นเช่น Streptococcus ซึ่งแม้จะเป็นจุลินทรีย์แบบไม่ใช้ออกซิเจนในทางปัญญาก็ไม่มีเอนไซม์ catalase
นั่นคือเหตุผลที่การทดสอบตัวเร่งปฏิกิริยาส่วนใหญ่ใช้เพื่อแยกความแตกต่างของตระกูล Staphylococaceae และ Micrococaceae (ทั้งตัวบวก catalase) ของ Streptococaceae ตระกูล (ลบเชิงลบ)
ในทำนองเดียวกันสกุล Bacillus (catalase positive) นั้นแตกต่างจากสกุล Clostridium (catalase เชิงลบ) และกลุ่มอื่น ๆ
มูลนิธิ
คาตาเลสเป็นเอนไซม์ที่จำแนกเป็นไฮเปอร์เพอร์ออกซิเดสซึ่งหมายความว่าพวกมันใช้ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H 2 O 2 ) เป็นสารตั้งต้น
ก็ยังถือว่าเป็น oxidoreductase เนื่องจากในปฏิกิริยาที่มีองค์ประกอบที่ทำหน้าที่เป็นผู้บริจาคอิเล็กตรอน (สารลด) และอื่น ๆ เป็นตัวรับอิเล็กตรอน (สารอนุมูลอิสระ)
คาตาเลสเป็นโปรตีนที่มีกลุ่มเทียมที่มีอะตอมเหล็กสี่ trivalent (Fe +++) ดังนั้นจึงเป็น homoprotein เฟอร์ริกไอออนยังคงออกซิไดซ์ในระหว่างการทำปฏิกิริยา
อาจกล่าวได้ว่าคาตาเลสเป็นเอนไซม์ล้างพิษเนื่องจากหน้าที่ของมันคือกำจัดสารที่ผลิตในระหว่างกระบวนการเมตาบอลิซึมของแบคทีเรียที่เป็นพิษต่อแบคทีเรีย ในบรรดาสารเหล่านี้คือไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เกิดจากการสลายตัวของน้ำตาลโดยใช้เส้นทางแอโรบิก กระบวนการนี้เกิดขึ้นดังนี้:
ไอออนซูเปอร์ออกไซด์ (O 2 -) (อนุมูลอิสระ) เกิดขึ้นเป็นผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายของการดูดซึมของกลูโคสโดยเส้นทางแอโรบิก นี่เป็นพิษและถูกกำจัดโดยเอนไซม์ซูเปอร์ออกไซด์ dismutase ที่เปลี่ยนมันให้เป็นก๊าซออกซิเจนและไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ยังเป็นพิษต่อแบคทีเรียและควรกำจัดด้วย เอนไซม์ catalase คลี่ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ออกมาในน้ำและออกซิเจน
Catalase สามารถทำหน้าที่บนพื้นผิวอื่นที่ไม่ใช่ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เช่นแอลกอฮอล์, อัลดีไฮด์, กรด, อะมีนอะโรมาติกและฟีนอล อย่างไรก็ตามไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ยังสามารถใช้โดย catalase เพื่อออกซิไดซ์สารประกอบพิษอื่น ๆ เช่นเมทิลและเอทิลแอลกอฮอล์
catalase มีอยู่ในเซลล์ phagocytic ปกป้องจากการกระทำที่เป็นพิษของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
เทคนิคประจำสำหรับการทดสอบ catalase
-Object method
วัสดุ
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3% (10 เล่ม)
เลื่อนกระจก
ด้ามพลาสติกทิ้งหรือแท่งไม้
กระบวนการ
ใช้อาณานิคมเพียงพอที่จะศึกษาโดยไม่ต้องสัมผัสกับวุ้นที่มาจากมัน อาณานิคมจะต้องสดใหม่นั่นคือจากวัฒนธรรม 18 ถึง 24 ชั่วโมง
วางอาณานิคมบนสไลด์แห้งและเพิ่มไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3% ลง (สามารถใช้ 30% H 2 O 2 ได้) สังเกตได้ทันทีถ้าปล่อยฟองหรือไม่
การตีความ
ปฏิกิริยาเชิงบวก: วิวัฒนาการของก๊าซซึ่งเป็นหลักฐานจากการก่อตัวของฟอง (เดือดปุด ๆ )
ปฏิกิริยาเชิงลบ: ไม่มีการก่อตัวของฟอง
- วิธีการโดยตรงในวัฒนธรรมที่บริสุทธิ์
วาง 1 มล. ของ 3% H 2 O 2 บนวัฒนธรรมบริสุทธิ์ในจานหรือเวดจ์ที่ไม่ได้มีเลือด สังเกตว่ามีฟองก่อตัวทันทีหรือไม่ คุณสามารถใช้ H 2 O 2 ได้ 30%
มันถูกตีความในลักษณะเดียวกับวิธีการย้ายวัตถุ
- วิธีการด้วยหลอดเส้นเลือดฝอยหรือ Fung และ Petrishko
เติมหลอดเส้นเลือดฝอยขนาด 67 มม. ที่ความสูง 20 มม. ด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3% โดยความเข้มข้น
สัมผัสอาณานิคมที่แยกได้ที่คุณต้องการศึกษาด้วยเส้นเลือดฝอยที่เต็มไปด้วย 3% H 2 O 2 สังเกตว่าเส้นเลือดฝอยเต็มไปด้วยฟองอากาศในเวลาประมาณ 10 วินาที วิธีนี้จะช่วยให้ปริมาณปฏิกิริยาในกากบาทกึ่ง:
ไม่มีกากบาทไม่มีฟองอากาศ (ปฏิกิริยาเชิงลบ)
+ ---- ฟองเล็ก ๆ น้อย ๆ (ปฏิกิริยาที่อ่อนแอหรือล่าช้า)
++ ฟองอากาศจำนวนมาก (ปฏิกิริยาปานกลาง)
+++ - ฟองสบู่จะไปถึงจุดตรงกันข้ามสุดขั้ว (ปฏิกิริยาที่กระฉับกระเฉง)
-Taylor และ Achanzar สำหรับการทดสอบ catalase ที่ให้หนี้สงสัยจะสูญ
บนสไลด์ที่สะอาดและแห้งให้วางอาณานิคมที่แยกได้จากนั้นวาง 0.5% H 2 O 2 และคลุมด้วยสลิป สังเกตว่ามีการก่อตัวของฟองอากาศที่ถูกขังอยู่หรือไม่
การตีความ: การปรากฏตัวของฟองอากาศบ่งบอกถึงปฏิกิริยาในเชิงบวก หากไม่มีฟองอากาศจะถูกตีความว่าเป็นปฏิกิริยาเชิงลบ
การทดสอบตัวเร่งปฏิกิริยาสำหรับสปีชีส์ Mycobacterium
เทคนิคนี้ต้องทำโดยการควบคุมค่า pH และอุณหภูมิ มันจะต้องวิ่งภายใต้กระโปรงชั้นไหลแบบราบเรียบเนื่องจากการขนถ่ายเชื้อมัยโคแบคทีเรียชนิดต่าง ๆ เป็นสิ่งที่อันตราย
-Materials
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ 30% หรือ 110 ปริมาตร (superoxal)
บัฟเฟอร์ฟอสเฟต PH 7
10% ทวี 80
การเพาะเลี้ยงเชื้อมัยโคแบคทีเรียมลิ่ม 3 ถึง 4 สัปดาห์
- การเตรียม สารรีเอเจนต์
บัฟเฟอร์ฟอสเฟต PH 7
เสียใจ:
1.361 กรัมของ monopotassium ฟอสเฟตปราศจาก (KH 2 PO 4 )
1.420 กรัมของไดโซเดียมด (Na2HPO3) ฟอสเฟต
ละลายเกลือทั้งสองในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วและเติมน้ำให้ได้มากถึง 1, 000 มล.
10% ทวี 80
สร้างการเจือจาง 1:10 ถึง Tween 80 ที่เข้มข้นในเชิงพาณิชย์ดังนั้นดำเนินการดังนี้:
ใช้ Tween 80 1 มล. แล้ววางในน้ำกลั่นเล็กน้อยละลายแล้วเติมปริมาตรด้วยน้ำให้ได้ 10 มล.
รีเอเจนต์สุดท้าย
ผสมบัฟเฟอร์ฟอสเฟตในปริมาณ 10% ทวีน 80 (ในส่วนเท่า ๆ กัน) กำหนดในห้องปฏิบัติการว่าคุณต้องการเตรียมตัวมากแค่ไหน
ขั้นตอน -a
วางบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 5 มล. ลงในหลอดทดลองที่ปลอดเชื้อพร้อมฝาเกลียว (Bakelite)
ด้วยการฉีดวัคซีนวนมากใช้เวลาพออาณานิคมของการเจริญเติบโตของ Mycobacterium เมล็ดในเวดจ์และละลายในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต
ครอบคลุมท่อโดยไม่ต้องกระชับเกลียวมากเกินไป วางในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 68 ° C เป็นเวลา 20 ถึง 30 นาที ลบและปล่อยให้เย็นที่ 22-25 ° C
วัด 0.5 มิลลิลิตรของรีเอเจนต์สุดท้าย (ส่วนผสม) และเพิ่มลงในหลอดด้วยสารละลายเย็น สังเกตการก่อตัวของฟองหรือไม่
มันถูกตีความเหมือนเทคนิคก่อนหน้า
ใช้
เมื่อได้รับการเติบโตของโคโลนีในสื่อที่ได้รับการเสริมแล้วควรทำการย้อมสีแกรมและการทดสอบตัวเร่งปฏิกิริยาบนโคโลนีที่ได้รับ นี่จะเป็นแนวทางให้นักจุลชีววิทยาเกี่ยวกับกระบวนการที่ต้องปฏิบัติตามเพื่อระบุตัวตนที่ชัดเจน
การควบคุมคุณภาพ
ในการประเมินการทำงานที่เหมาะสมของรีเอเจนต์ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ให้ใช้สายพันธุ์ควบคุมที่ได้รับการเพาะเลี้ยงสดใหม่เช่น Staphylococcus aureus เพื่อควบคุมเชิงบวกและสายพันธุ์ของ Streptococcus sp เป็นตัวควบคุมเชิงลบ
อีกทางเลือกหนึ่งที่ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมเชิงบวกคือการวางไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ลงบน agar ในเลือดเม็ดเลือดแดงนั้นมีตัวเร่งปฏิกิริยาดังนั้นจะมีฟองถ้าสารรีเอเจนต์อยู่ในสภาพดี
ช็อคโกแลตวุ้นสามารถใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบได้ที่นี่เม็ดเลือดแดงถูก lysed แล้วและการทดสอบเป็นลบ
ข้อ จำกัด
- อย่าใช้วัฒนธรรมเก่าแก่สำหรับการทดสอบเพราะอาจทำให้เกิดการลบที่ผิดพลาดได้
- หลีกเลี่ยงการใช้อาณานิคมจากวัฒนธรรมใน agar blood ถ้ามีการดูแลไม่ให้สัมผัส agar; ขั้นตอนนี้อาจทำให้เกิดผลบวกปลอมเนื่องจากเม็ดเลือดแดงประกอบด้วย catalase
- หากคุณนำอาณานิคมที่มีด้ามจับทองคำขาวอย่าย้อนลำดับของโพรซีเดอร์เนื่องจากอาจทำให้เกิดผลบวกปลอมได้ นี่เป็นเพราะแพลตตินัมสามารถทำปฏิกิริยากับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ทำให้เกิดฟอง
- ห้ามใช้น้ำยารีเอเจนต์ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ถ้ามันเก่าเกินไปเนื่องจากน้ำยาไม่เสถียรและมีแนวโน้มที่จะสลายตัวตามเวลา
- เก็บน้ำยาไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ป้องกันจากแสงและในเครื่องทำความเย็นเพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหาย
- ดำเนินการควบคุมคุณภาพของรีเอเจนต์ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ในแต่ละครั้งที่ใช้งาน
- พิจารณาว่าหากใช้ H 2 O 2 ที่ 30% ปฏิกิริยาจะรุนแรงกว่าปฏิกิริยาที่ทำด้วย 3% H 2 O 2
